Diberdayakan oleh Blogger.

Teknik Pembuatan Sediaan(preparat) untuk Pemeriksaan Sitologi Dan Pemeriksaan Histologi Di laboratorium Patologi Anatomi.

Patologi Anatomi Adalah spesialis medis yang melakukan diagnosis penyakit berdasarkan pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, molekul atas organ, jaringan, dan sel. Yang melakukan diagnosis penyakit berdasarkan patologi anatomi adalah Spesialis patologi anatomi

Spesialis patologi anatomi mendiagnosis penyakit seseorang berdasar pemeriksaan laboratorium. Ada beberapa teknik pemeriksaan di laboratorium patologi anatomi diantaranya pemeriksaan Histologi (morfologi jaringan) atau Sitologi (Morfologi sel). Pada pemeriksaan lab analis kesehatan(teknisi laboratorium) bertugas membuat sediaan/preparat jaringan atau sel yang didapat dari si pasien. Sediaan harus dibuat sebaik mungkin agar spesialis dapat melakukan diagnosis yang akurat.

Disini akan diuraikan secara singkat teknik pembuatan sediaan pemeriksaan sitologi dan pemeriksaan histologi dilaboratorium Patologi Anatomi.

A. Sediaan untuk Pemeriksaan Sitologi

Pada pemeriksaan sitologi yang diperiksa morfologi sel-sel cairan tubuh. Sediaan atau disebut duga preparat dibuat berupa apusan pada objek glass yang diwarani dengan pewarnaan tertentu.

1. Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Giemza

Tujuan : Terutama yang diperiksa adalah detail dari morfologi untuk memeriksa intisel, untuk melihat apakah sel tersebut sel normal, sel noeplasma jinak atau ganas.

Sampel : Aspirasi Jarum Halus (AJH), Endapan cairan yang telah disentrifuge

Bahan :

- Larutan pewarna giemza

- Larutan Phosfat buffer (ph 6,8)

- Methanol

Prosedur kerja :

1) Sediaan apus telah benar-benar kering di udara

2) Fiksasi dengan methanol minimal 5 menit

3) Cuci dengan aquadest, biarkan kering di udara

4) Tetesi dengan pewarna Giemsa dengan perbandingan (GZ : Bufer phosfat = 1:4)

5) Cuci dengan aquadest, kering diudara

6) Tutup EZ Mount

2. Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Papaniculo

Metode ini umumya digunakan untuk pewarnaan Papsmear (tapi terkadang ada juga selain papsmear diwarnai dengan metode ini).

Papsmear digunakan untuk mendignosis Kanker serviks. Melihat ada tidaknya sel ganas

Sampel : apusan daerah peralihan endoserviks.

Bahan:

-Haematoksilin mayer

-EA (Eosin alkohol) 65/EA 36

- Alkohol 95% dan Alkohol absolut

Untuk EA 65 isinya: Eosine Y, Phospotung stic acid, light green, alk. Absolute

Prosedur Kerja :

1) Sedian apusan difiksasi dengan alcohol 95% 15 menit

2) Air mengalir sampai bebas alkohol 5 menit

(rak preparat diletakan di wadah yang di beri air mengalir)

3) Mayer haematoksilin 3-5 menit

4) Air Mengalir 15 menit

5) –Alkohol 95% 10 kali celup

-Alkohol 95% 10 kali celup

6) EA 3-5 menit

7) –Alkohol 95% 5 kali celup

-Alkoho 95% 5 kali celup

- Alkohol absolute 5 kali celup

8) Keringkan diudara

9) Xylol/clearing

10) Tutup dengan EZ mount

Foto : peralatan pengecatan

Hal-hal yang harus diperhatikan untuk pembuatan sediaan/preparat papsmear:

- Pengambilan sampel harus mendapat sel-sel endoserviks sel-sel metaplasia dan sel-sel skuamosa (komponen daerah peralihan), harus harus sedikit mungkin mengandung darah.

- Sediaan harus segera difiksasi dengan alkohol 95%. Preparat yang kering belum difiksasi akan menyebabkan sel-sel rusak. Apabila tempat pengecatan jauh,setelah difiksasi keringkan dan masukkan kewadah yang dapat menjaga keamanan sediaan.

- Jika menggunakna hairspray tidak boleh terlalu dekat, karena akan menghapus atau tidak terfiksasi dengan baik.

*Kesalahan pada kriteria yang diatas bisa menyebabkan negatif

palsu.

*Kesalahan pada pewarnaan dan screening dapat menyebabkan positif palsu.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sediaan sitologi dan fiksasinya:

1. Objek glass harus benar-benar bersih, terus beri nomor sesuai data biar tidak tertukar,

2. ¾ luas kaca objek memanjang, kita apus merata,tidak terlalu tebal dan terlalu tipis

3. Segera fiksasi sesuai dengan pewarnaan yang akan digunakan

4. Untuk cairan, disentrifuge dahulu dan kemudian diambil untuk diproses

5. Untuk bahan sputum diambil bagian berwarna dan kental untuk dibuat pulasan. Bagian yang lain bisa gunakan sebagai sel blog.

B. Sediaan untuk Pemeriksaan Histologi

1. Tahap periksaan dimulai dari penerimaan sampel di tata usaha. Petugas penerima harus mengecek kembali sampel tidak boleh asal terima.

- Jaringan atau organ yang diterima harus dalam keadaan terfiksasi dengan formalin buffer 10%(perbandingan jaringan dan cairan fiksasi, 1:9 ) dan ditutup rapat.

* Buffer formalin 10% :

1. formaldehid 40% H.CHO = 100 ml

2. Sodium Phospat monobasic NaH2PO4.H2O = 4 gram

3. Sodium Phopat dibasic Na2HPO4 = 6.5 gram

4. Aquadest = 900 ml

- Identitas pasien harus dilengkapi seperti, nama, umur, jenis kelamin, alamat, pekerjaan,riwayat penyakit, Dibagian yang ingin diperiksa.

- Jenis sampel sampel harus di Cross check, apa sama jenis sampel yang ditulis dengan yang diterima

- Dan harus di tanya bagai mana menyampaian hasil pemeriksaan, Jika pasien ingin mengambil sampel sendiri harus ada surat pengantar.

- Nama dan alamat dokter pengirim sampel harus ada,

Dokter pengirim harus diingatkan jika ada yang tidak sesuai kriteria.

2. 2 Pemeriksaan Makroskopis

Pemeriksaan makaroskopis dilakukan oleh dokter tugas analis kesehatan/teknisi laboratorium mendampingi dokter, melakukan pencatatan hasil pemeriksaan dokter. Pada tahap ini dokter juga akan memotong jaringan yang dicurigai

3. Foto : Jaringan yang sudah dipotong

Processing Jaringan

Untuk prosessing jaringan memakai alat tissue prosessor automatic yang bekerja ± 18,5 jam(bisa diubah sesuai kebutuhan). Tahapan prosessing jaringan yaitu, Fiksasi, Dehidrasi, clearing, dan infiltrasi paraffin.

Foto : Tissue Automatics Prosessor

Tahapan kerja pada Tissue Automatics Prosessor

1) Fiksasi

Botol 1. Buffer Formalin 10% 2 jam

2) Dehidrasi

Botol 2. Alkohol 70% 1,5 jam

Botol 3. Alkohol 80% 1,5 jam

Botol 4. Alkohol 95% 1,5 jam

Botol 5. Alkoho absolute I 1,5 jam

Botol 6. Alkoho absolute II 1,5 jam

Botol 7. Alkoho absolute III 1,5 jam

3) Clearing

Botol 8. Xylol I 1 Jam

Botol 9. Xylol II 1,5 Jam

Botol 10. Xylol III 1,5 Jam

4) Infiltrasi paraffin

Botol 11. Paraffin cair I 1,5 jam

Botol 12. Paraffin cair II 2 jam

Jumlah 18,5 jam

Fiksasi

Tujuan : Untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi stabil secara fisik dan kimiawi dan mencegah terjadi dialysis atau pembengkakan pada rupture.

Rumus yang digunakan untuk memonitor fiksasi baik atau buruk diuji dengan rumus:

d = k √t

d = ketebalan jaringan (mm)

t = waktu yang dibutuhkan/tersedia

k = ketetapan daya fiksir dari atas dan bawah (2 X ketetapan masing-masing fiksasi)

Ketetapan fiksasi formalin 10% = 0.78

Dehidrasi

Tujuan : untuk menghilangkan/menarik air dalam jaringan dengan cara mulai konsentrasi terendah sampai konsentrasi tinggi.

Clearing

Tujuan : Menarik keluar kadar alcohol yang berada dalam jaringan, memberi warna yang bening pada jaringan dan juga sebagai perantara mesuknya kedalam paraffin.

Zat yang sering dipakai Xylol, tapi bisa juga dipakai : benzol, benzene, toluol,dll.

Untuk jaringan otak dan limfonoid lebih baik menggunakan koloform.

Infiltrasi paraffin

Tujuan : Mengisi rongga atau pori-pori yang ada pada jaringan setelah setelah ditinggal cairan sebelumnya(xylol).

Jumlah waktu : 18,5 Jam

4. . Pengeblokkan

Tujuan : Agar mudah dipotong menggunakan mikrotom untuk mendapatkan irisan jaringan yang sangat tipis (sesuai yang diharapkan).

Foto : Cetakan

Cara Kerja :

1) Hangatkan paraffin cair, pinset, dan penutup cetakan

2) Parafin cair dituangkan kedalam cetakan

3) Jaringan dari prosessing dimasukan kedalam cetakan yang telah disi paraffin cair, tekan jaringan agar semakin menempel di dasar cetakan.

4) Tutup cetakan diambil, letakkan diatas cetakan dan di tekan.Pasang etiket di pinggir.

5) Biarkan sampai membeku

6) Setelah beku, keluarkan dari cetakan. Rapikan sisi-sisi blog. Ganti etiket dengan yang permanen

Foto : cetakan yang telah diisi jaringan dan paraffin

Foto : Blok jaringan

Foto : Blok jaringan

5. Pemotongan dengan Mikrotom

Foto : Mikrotom

Foto : Mikrotom dengan blok jaringan

1) Sebelum pemotongan Masukan kedalam plastik yang diisi air dan letakkan di freezer ±15 menit atau diberi batu es.

2) Blok dijepit pada mikrotom kemudian dipotong dengan pisau mikroto.

Kemiringan : ±300 , Tebal blok paraffin ±2-5mikron.

3) Hasil pemotongan (berupa pita/irisan tipis yang saling bersambung) dimasukkan kedalam waterbath yang diisi air yang sudah dihangatkan 50 0 C, kemudian diambil dengan kaca objek (Meletakkan potongan di waterbath tidak boleh terbalik).

Foto : Waterbath

Cttn : Pisau dan waterbath bisa diberi alcohol 50% untuk menurunkan tegangan permukaan yang membantu merentangkan pita.

Objek glass jangan diolesi albumin gliserin karena biasanya albumin bila diinkubasi akan mengeras.menjaga agat jangan lepas saat pengecatan

6. Inkubasi

Tujuan : Menguapkan air yang terbawa oleh hasil potongan hingga jaringan menempel lebih kuat.

Cara kerja : inkubasi preparat di atas hot plate dengan suhu±500 C(dibawah titik cair paraffin) selama 15 menit

· Sebaiknya dialasi dengan kertas merang.

· Untuk pengecatan imunnohistokima inkubasi 390C selama 1 malam

7. Pengecatan

Umumnya dalam pengecatan histopatologi digunakan cat Hetatoxylin-Eosin (HE) disamping cat khusus (PAS, gomori, ZN, Malory, dll) dan cat yang lebih khusus yaitu immunohistokimia (ER, PR, CD20, LMP, dll)

Foto : Peralatan pengecatan

Proses pengecatan :

1) Deparafinisasi

Preparat masuk ke Xylol I, II, dan III masing-masing 3 menit

Setelah itu dilap pinggir jaringan dengan kain kasa.

2) Rehidrasi

Preparat masuk ke alcohol 100%, 95%, 80%, 70% masing-masing 2 menit

3) Preparat masuk ke air mengalir 3 menit

(air mengali ditampung dalam wadah )

Sebelumnya celup kedalam dua mangkok air 3 celup

4) Pengecatan Inti 7 menit

Preparat masuk ke dalam Meyer hematoksilin

5) Preparat masuk ke air mengalir 3 menit

(air mengali ditampung dalam wadah )

Sebelumnya celup kedalam dua mangkok air 3 celup

6) Counter Stain

Preparat masuk ke larutan eosin 7 celup

7) Preparat Masuk ke air wadah I, II, dan III 3 celup

8) Dehidrasi

Preparat masuk ke dalam alcohol 70 %, 80%, 95%,100% 3 celup

Setelah itu Dilap dengan kain kasa sekitar jaringan

dan tunggu sampai kering

9) Clearing

Preparat masuk Ke Xylol I, dan II masing-masing 2 menit

10) Mounting

11) Preparat diberi 1 tetes entelan dan ditutup objek glass

Foto : Peralatan pengecatan

Foto : Preparat/sediaan histologi

Ket :

Deparafinisasi

Tujuanya : Berfungsi melarutkan/melepaskan paraffin yang melekat pada preparat.

Rehidrasi

Berfungsi menghilangkan xylol yang terbawa oleh preparat dan memasukan air kedalam jaringan

Air mengalir

Melepaskan sisa cat atau cairan yang terbawa sebelumnya

Meyer Hematoksilin

Memberikan warna biru pada inti sel

Eosin

Memberi warna merah pada sitoplasma, jaringan ikat,dll

Dehidrasi

Melepaskan aira yang terbawa preparat

Clearing

Melepastan alcohol yang terbawa oleh preparat dan memberi warna bening pada preparat

Mounting

Memberi warna cerah dan sebagai pelindung dan pengawet jaringan dari mikroba dan bakteri.